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    枣庄市伟德国际生物酶有限公司
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    行业资讯

    过氧化氢酶活性测定(高锰酸钾滴定法)

     过氧化氢酶活性测定(高锰酸钾滴定法)

    过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中,其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系,故常加以测定。
          一、原理   过氧化氢酶(catalase)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的过氧化氢溶液,经酶促反应后,用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。
          二、材料、仪器设备及试剂
          (一)材料:小麦叶片
          (二)仪器设备:1. 研钵;2. 三角瓶;3. 酸式滴定管;4. 恒温水浴;5. 容量瓶。
          (三)试剂:1. 10%H2SO42. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液;3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称:取KMnO4AR3.1605g,用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml,再用0.1mol/L 草酸溶液标定;4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L,取30%H2O2溶液5.68ml,稀释至1000ml,用标准0.1mol/L KMnO4溶液(在酸性条件下)进行标定;5. 0.1mol/L 草酸:称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g,用蒸馏水溶解后,定容至1000ml
          、实验步骤
          (一)酶液提取:取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量,研磨成匀浆,转移至25ml容量瓶中,用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转至容量瓶中,用同一缓冲液定容,4000rpm离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
          (二)取50ml三角瓶4个(两个测定,另两个为对照),测定瓶加入酶液2.5ml,对照加煮死酶液2.5ml,再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2,同时计时,于30恒温水浴中保温10min,立即加入10%H2SO42.5ml
          0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定,至出现粉红色(在30min内不消失)为终点。
          、结果计算
          酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2mg数表示:
          过氧化氢酶活性(H2O2mg/g/min)=(AB×VT/(W×VS×1.7×t)
          式中:A对照KMnO4滴定ml数;B酶反应后KMnO4滴定ml数;VT提取酶液总量(ml);   

    VS反应时所用酶液量(ml);W样品鲜重(g);t反应时间(min);
          1.71ml0.1mol/L KMnO4相当于1.7mgH2O2
         过氧化氢酶的活性测定 

      在植物体中, 黄素氧化酶类的代谢产物常包含H2O2,如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸

    作用中的葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、醛氧化酶等。H2O2的积累可导致破坏性的氧化作用,

    而过氧化物酶和过氧化氢酶则可以清除H2O2, 是植物体内重要的活性氧清除系统之一。其活

    性还与植物的抗逆性有密切关系,本实验利用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性。

        一、原理:过氧化氢酶属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,

    在此过程中起传递电子的作用,H2O2则既是氧化剂,又是还原剂。

        R(Fe+2)H2O2=====R(Fe+3OH-)2

        R(Fe+3OH-)2H2O2===R(Fe+2)22H2OO2

        合并上式:2H2O2====2H2OO2

        据此,可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。

        在反应系统中加入一定量(反应过量) 的过氧化氢溶液,经酶促反应后,用标准高锰酸

    钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的过氧化氢。

        5H2O22KMnO44H2SO45O22KHSO48H2O2MnSO4

        即可求出消耗的H2O2量。

        二、仪器和用具:研钵、三角瓶50cm3×4、铁架、酸式滴定管、恒温水浴、容量瓶

        三、试剂:

        10H2SO40.2mol/l磷酸缓冲液pH7.8

        0.1mol/l高锰酸钾标准液: 3.1605gKMnO4  (AR) 用新煮沸的蒸馏水配制成1000ml, 用

    0.1mol/l的草酸溶液标定;

        0.1mol/l  H2O2:  市售30H2O2大约等于17.6mol/l,  取30H2O2溶液5.68ml稀释至

    1000ml,用标准0.1mol/l KMnO4溶液(在酸性条件下)进行标定。

        四、方法:

        1. 酶液提取: 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲液少量,研磨成匀浆,转移至25ml

    容量瓶中,将研钵冲洗干净,冲洗液转移至容量瓶中,并用同一缓冲液定容,4000rpm离心,

    上清液即为过氧化氢酶粗提液。

        2. 50ml三角瓶4个 (两个测定两个对照) , 测定加入酶液2.5ml, 对照为煮死酶液

    2.5ml; 再加入2.5ml 0.1mol/l H2O2,同时计时间,于30℃恒温水浴中保温10分钟,立即加

    10H2SO4 2.5ml

        3. 0.1mol/l KMnO4标准溶液滴定H2O2,至出现粉红色(在30分钟内不消失)为终点。

        4. 结果计算:

        酶活性用每克鲜重样品在10分钟内分解H2O2的毫克数表示:

        

                                       (A-B)*Vt/V1*1.7

        酶活(酶分解的H2O2 mg/g鲜重)=-------------------

                                             W

        式中:  A-----对照用KMnO4 ml数        B-----酶反应后KMnO4滴定ml

                Vt----酶液总量ml         1----反应所用酶液量ml      -----样品鲜重(g)

                1.7----1ml 0.1mol/l KMnO4相当于1.7mg H2O2

          [注意].所用KMnO4溶液及H2O2溶液使用前要经过标定,0.1mol/l H2O2要新配制。

    过氧化物酶活性的测定(比色法) 

    过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶,它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系,在植物生长发育过程中,它的活性不断发生变化,因此测量这种酶,可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 

    一、原理 

    在有过氧化氢存在下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色物质,该物质在 470 nm 处有最大吸收,可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。 

    二、实验材料、试剂与仪器设备 

    (一)实验材料 

    马铃薯块茎。 

    (二)试剂 

    1 . 100 mmol / L 磷酸缓冲液 pH6.0 (见附录)。 

    2 .反应混合液: 100 mmol / L 磷酸缓冲液( pH6.0 ) 50 mL 于烧杯中,加入愈创木酚 28 μl ,于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入 30 % 过氧化氢 19 μl ,混合均匀,保存于冰箱中。 

    (三)仪器设备 

    分光光度计,研钵,恒温水浴锅, 100 mL 容量瓶,吸管, 离心机。 

    三、实验步骤 

    1 .称取植物材料 1 g ,剪碎,放入研钵中,加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆,以 4000 r / min 离心 15 min ,上清液转入 100 mL 容量瓶中,残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,贮于低温下备用。 

    2 .取光径 1 cm 比色杯 2 只,于 1 只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ,作为对照,另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL (如酶活性过高可稀释之),立即开启秒表记录时间,于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值,每隔 1min 读数一次。 

    四、结果计算 

    以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小,即以 ΔA 470 /[min · g (鲜重) ] 表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位( u )表示。 

    过氧化物酶活性 [u/ ( g · min ) ]= 

    式中: Δ 470 ——反应时间内吸光度的变化。 ——植物鲜重, g 。 

    V T ——提取酶液总体积, mL 。 

    V s ——测定时取用酶液体积 , mL 。 

    ——反应时间, min 。 

    蒲圻贝母Fritillaria puqiensis G.D.Yu et G.Y.Chen是贝母属中一新种,其有效成分生物碱含量较高,止咳效果显著[1,2]。其中的蒲贝酮碱的效果与可待因相似,且无成瘾性,已被国家新药办立项进行一类新药开发。但由于蒲圻贝母以野生为主,连年的采挖已使其资源逐渐枯竭,难以为新药开发提供资源保证,为此我们对其进行了组织培养。蒲圻贝母鳞茎切块培养22d左右,可直接从切片边缘长出多个小鳞茎,以后小鳞茎逐渐长大。为了探讨鳞茎发生的机理,并为研究提高组培贝母鳞茎的生长率,诱发多鳞茎形成的方法,我们在培养的不同时期取材,对鳞茎形成过程中的可溶性蛋白,过氧化物酶及酯酶同工酶的酶谱变化进行了分析。

    1 材料和方法
    1.1 材料
      蒲圻贝母F.puqiensis取自湖北省蒲圻市,经中国药科大学生药教研室李萍博士鉴定。
      新鲜的蒲圻贝母鳞茎在流水下冲洗3h,0.1%氯化汞表面消毒20min,无菌水冲洗5次,切成0.5cm×0.5cm×0.2cm的小块接种于MS附加BA 2mg/L-1,IAA 1mg/L-1的培养基上,在25℃黑暗条件下培养,获得无菌材料。分别在培养的不同时间取材,并以未进行培养的新鲜贝母鳞茎为对照,进行可溶性蛋白,过氧化物酶及酯酶同工酶酶谱分析。
    1.2 方法
    1.2.1 试剂的配制与凝胶的制备:参考文献[3]的方法。分离胶浓度为7.5%,间隔胶浓度为2.5%。
    1.2.2 样品制备:称取新鲜的贝母鳞茎1g,在低温冰箱内放置1h后,加少许石英砂,加3ml提取缓冲液(0.1mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液,其中含0.5mol/L蔗糖,0.06mol/L抗坏血酸,0.006mol/L半胱氨酸),在低温下研磨后离心 20min,5000r/min,取上清液置-20℃下保存。
    1.2.3 电泳:采用垂直板式聚丙烯酰胺凝胶电泳,加入溴酚蓝作为指示染料。稳定电流强度为12~24mA。可溶性蛋白的点样量为50μl,用含0.05%考马斯亮蓝的12.5%三氯乙酸溶液染色4h。过氧化物同工酶的点样量为30μl,用抗坏血酸-联苯胺染液染色,其组成为抗坏血酸70.4mg,联苯胺储存液20ml(2g联苯胺溶于18ml文火加热的冰醋酸中,再加水72ml),0.6%过氧化氢20ml,水60ml。酯酶同工酶的点样量为50μl,按薛应龙[4]方法,即凝胶在0.2mol/L,Tris-HCl缓冲液(pH 7.1)预浸10min,然后移入含有7%醋酸-α-萘酯的丙酮溶液0.5ml,坚牢蓝12.5mg,0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.1)1ml,水23.4ml的染色液中染色10~30min,棕红色的同工酶谱带即呈现。

    2 结果与分析
      按谱带颜色的深浅程度将其划分为重带、次重带、轻带,并按迁移率的大小划分为3个区,Rf在0.1~0.3为慢速区(A),在0.4~0.6为中速区(B),在0.7~0.9为快速区(C)。

    关键字:过氧化氢酶活性测定(高锰酸钾滴定法)
    录入时间:2012-6-20 Hits:5421

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